L’électrofusion a été présentée pour la première fois par Zimmerman au début des années 80. Beaucoup de travaux actuels sont basés sur ces publications. Les systèmes Cyto Pulse sont tous basés sur le champ électrique entraînant une haute viabilité cellulaire et efficacité de fusion. Il y a 4 étapes distinctes:
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alignement et concentration des cellules
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fusion des cellules
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maintien des cellules en place pendant que la membrane mature
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ajustement de l’environnement et des nutriments pour la maturation des cellules
La première étape consiste à aligner et concentrer les cellules. Dans cette étape, les deux types cellulaires sont placés dans une chambre contenant un milieu à faible conductivité. C’est une étape critique car les cellules ne peuvent pas survivre dans un milieu de culture classique comme le PBS et même si elles survivent, les cellules ne vont pas se comporter normalement. Le milieu de fusion cellulaire a une faible conductivité (haute résistance). Les ondes initiales appliquées durant le procédé provoqueraient une chauffe excessive si un milieu plus conductif était utilisé. Les autres paramètres critiques sont les faibles molarités de cations bivalents et des tampons.
L’étape suivante met les cellules en contact par le procédé dit de di-électrophorèse. La di-électrophorèse correspond à l’alignement cellulaire par application d’un champ électrique alternatif non uniforme.
Le schéma ci-dessous illustre cette étape; La physique dit qu’un champ électrique n’applique pas de force sur un corps qui n’a pas de charge. Une cellule vivante n’a pas de charge nette, donc un champ électrique uniforme n’appliquera pas de force sur la cellule. La di-électrophorèse utilise un champ électrique non uniforme. Dans ce cas les charges à l’intérieur de la cellule se répartissent et la cellule est polarisée. L’extrémité chargée positivement de la cellule va alors migrer en direction de l’électrode négative. Les cellules vont alors s’aligner avec la charge positive d’une cellule contre la charge négative de la cellule adjacente.
Première étape: alignement des cellules
La seconde étape est de soumettre les cellules à une ou plusieurs impulsions de champ électrique intense pour initier la fusion cellulaire. Les exigences pour cette impulsion sont similaires à celle de l’électroporation. Un seuil de champ électrique est exigé pour créer le voltage transmembranaire requis. Les membranes cellulaires des cellules adjacentes vont commencer à fusionner à partir de ce seuil.
Deuxième étape: initiation de la fusion cellulaire
La troisième étape est d’appliquer de nouveau un faible champ électrique non linéaire pour maintenir les cellules en place pendant que les membranes fusionnées maturent et que le cytoplasme s’homogénéise. Le phénomène d’électrofusion cellulaire commence au moment de l’application des impulsions de champ électrique élevé, et continue quelquefois après que les impulsions ont été appliquées. C’est pour cette raison que la di-électrophorèse est appliquée après la délivrance des impulsions de champ électrique élevé.
Cela permet de maintenir les cellules alignées pendant la période la plus critique de la fusion cellulaire: la maturation. Le phénomène de fusion se prolonge pendant les 10 à 30 minutes suivantes, il est alors fortement recommandé de ne pas bouger les cellules pendant cette période. Pendant la maturation de la fusion cellulaire, les composants de la membrane cellulaire et les cytoplasmes commencent à se mélanger. L’image précédente montre le mélange des cytoplasmes durant la fusion cellulaire. Le jaune indique le mélange de cellules colorées en vert et rouge.
Troisième étape: maintien des cellules durant la maturation
Pour la quatrième étape, après la maturation de la fusion des cellules membranaires, les cellules sont placées dans un milieu de culture favorisant la viabilité et la croissance cellulaire.
Des fusions cellulaires de cellules K562 sont illustrées ci-dessous à gauche. Les cellules ont fusionnées et ont été laissées 45 minutes pour maturation. Un aliquot de cellules a été placé sous microscope (centrifugé dans un Cytospi, Shandon,Inc). Les cellules ont été colorées avec le colorant Hema 3 et photographiées. La cellule géante multi nucléée est un exemple extrême de ce qui est possible d’obtenir. Les paramètres électriques peuvent être choisis de sorte à produire moins de grosses cellules. Des cellules contenant 2 noyaux sont aussi présentes. L’image de droite montre la fusion entre des cellules dendritiques (rouge) et des cellules tumorales A549 (brun).
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